内容导读
血小板活性异常可导致出血倾向或血栓形成，是多种疾病过程的次要因素，会造成不同程度的临床后果。本文将讨论血小板功能异常的病理生理学，介绍检测血小板功能的最新研究进展，探索适用于兽医临床实践的逻辑诊断方法，讨论血小板相关疾病的发病机理。
1
正常血小板解剖生理
血小板是哺乳动物血小板分裂过程中从巨核细胞脱落的无核细胞质小块，释放到血液中就形成血小板。巨核细胞成熟和血小板释放所需的时间约为3-5天。据报道，实验犬的血小板寿命为6.0±1.1天，猫无相关数据。血小板大小在同种属和不同种属间均有差异，猫的血小板通常较小，不同品种的犬间也有差异。值得注意的是查理王犬和秋田犬的血小板减少症综合征，以及猎犬的相对血小板减少症，由于可维持足够的血小板总量，因此不会出现出血倾向。血小板有几个关键的解剖学特征。如图1所示：1.介导粘附受体的高密度磷脂膜（见表1）。2.由丰富的收缩蛋白（如肌动蛋白和肌球蛋白）组成的细胞支架，与血小板变形运动相关。3.一种能隔离和释放钙的致密管系统。4.能够对各种外界刺激做出反应的分泌型颗粒：α颗粒：释放粘附蛋白，如纤维蛋白原和血小板；凝血酶原，如V和XI和生长因子，以促进血管愈合；电子致密颗粒：释放大量血小板活化所需的血小板激活剂，包括二磷酸腺苷（ADP）、肾上腺素、血清素、组胺和钙离子。图1血小板的重要解剖特征原发性止血依赖于多种受体的协同作用，促使血小板稳定聚集，该聚集物称为血小板塞。原发性止血的三个关键阶段是血小板粘附、活化和聚集。这些阶段同时发生，可以产生足够的血小板聚集以恢复血管完整性。任何一个阶段异常都可能导致血小板型出血或血栓形成。粘附生理性止血只在血管壁损伤时才会触发。血管损伤暴露内皮下基质蛋白，主要是胶原蛋白，血小板可以与之结合。最初的止血血栓主要是通过GPVI受体直接与胶原结合或通过血管性血友病因子（vWF）与血小板表面的GP1b-IX-V结合间接粘附于胶原组织。后者在动脉循环中高血流部位相关性增加，该部位摩擦力小（或“剪切力”）使血小板直接结合困难。这两种过程都是短暂的，但可激活血小板信号通路，从而使整合蛋白受体转化为高亲和力状态。这使得直接通过α2β1整合蛋白或利用vWF间接αIIbβ3整合蛋白与胶原蛋白的粘附更加稳定。粘附过程如图2所示。vWF是一种较大的糖蛋白，正常情况下以多聚体的形式存在，较大的多聚体与血小板亲和力更高。主要由内皮细胞和巨核细胞产生，储存于内皮细胞Weibel-Palade小体、血小板的α颗粒中。与猫相比，犬的vWF较少。vWF在血小板与内皮下基质之间起桥梁作用，与VIII因子结合，可保护FVIII因子过早降解，有利于其参与凝血过程。血管损伤后，vWF多聚体从内皮细胞释放，与胶原蛋白结合后结构域磷酸化，暴露GPIb/V/IX血小板结合位点。也可直接结合血小板不经过胶原蛋白。血小板粘附和活化可刺激α颗粒释放更多vWF，同时其他物质也可刺激vWF释放，如炎症产生的凝血酶。多聚体的大小受金属蛋白酶，尤其是“血管性血友病因子裂解酶”（ADAMTS-13）的调控，主要由内皮细胞产生。多聚体可降低血小板结合，当vWF多聚体与血小板结合易被ADAMTS-13裂解，从而抑制负反馈。但ADAMTS-13缺陷（突变或缺失），致使其活性降低，形成过多超大的vWF多聚体，可促发病理性血小板聚集和血栓形成。据报道，继发于肿瘤、炎症、自身免疫性疾病等疾病的人类体内ADAMTS-13水平较低。图2介导血小板粘附的主要受体图示活化和信号放大粘附的血小板进一步激活血小板内信号通路，修饰血小板聚集所需的蛋白质，如：1.整合蛋白受体，最重要的是αIIbβ3转化为高亲和力状态。2.细胞膜“翻转”以暴露磷脂“磷脂酰丝氨酸”。为凝血因子的聚集和凝血酶的生成创造了一个带负电荷的促凝表面。3.血小板形态改变所必需的收缩蛋白，可增加结合面积并允许纤维蛋白凝块收缩。4.颗粒物释放。糖蛋白，如P-选择素，在脱颗粒过程中转移到血小板表面，可以提供激活的间接证据。为恢复血管的完整性，需通过血小板激活剂放大和维持血小板活化的原始刺激。血小板激活剂包括内皮下基质（如胶原蛋白）、血小板本身（如分泌型颗粒或细胞膜分解产物：血栓烷、其他细胞（如肾上腺素）或通过激活凝血级联反应（如凝血酶））。不同的激活剂作用于不同的受体来刺激血小板聚集，可通过增加细胞内钙离子浓度以触发细胞内信号，或抑制环磷酸腺苷（cAMP），后者通常维持血小板处于失活状态。钙离子的释放是由磷脂酶C（PLC）通路的激活触发，磷脂酰肌醇水解为第二信使，诱导细胞内钙离子释放，并激活血小板信号转导所需的其他酶。磷脂酶A2（PLA2）途径通过PLC途径和最初血小板聚集间接激活。这一途使磷脂分解为花生四烯酸，在环氧合酶（COX）作用下转化为血栓烷A2（TXA2）。TXA2是一种有效的血小板激活剂，允许自分泌和旁分泌信号传导。这种途径可被COX酶抑制剂阻断。细胞内信号通路如图3所示。图3细胞内信号通路示意图聚集血小板聚集是指激活的血小板受体与纤维蛋白原结合，而导致激活血小板之间的相互粘附。αIIbβ3整合蛋白受体在高剪切力位点也能与vWF结合。溶性纤维蛋白原在血浆中游离存在，但在血小板被激活之前不能与之结合。因此，血小板激活剂的持续作用需要提供足够的聚集体。
2
原发性止血的抑制
血小板聚集还须克服几种抑制机制：1.内皮细胞释放前列环素和腺苷二磷酸酯酶（ADPases），通过PLA2途径抑制TXA2的产生或激活cAMP途径抑制血小板活化。2.带负电荷的糖胺聚糖（GAGs）和蛋白多糖，称为“糖萼”，覆盖于血管内皮细胞表面并抑制凝血酶的形成。糖萼也会在血液流速高的部位释放一氧化氮（NO），从而抑制血小板聚集。
3
血小板功能异常导致出血
出血可继发于血小板定量和/或定性疾病、vWF或血管病变。“血小板型出血”表现为瘀斑和/或瘀点及术中出血，一般可与继发性凝血疾病相区分，继发性凝血疾病以腔内出血、血肿和积血最为常见。粘膜出血（临床上无症状或表现为尿或胃肠道出血）可见于原发性或继发性凝血障碍。血小板数量少（血小板减少症）是血小板型出血的最常见原因，在进一步研究血小板功能之前，应将其排除在外。血小板计数参考下限为x/L，目前尚不清楚血小板减少症的严重程度是否会导致自发性出血。但血小板计数低于30×/L与犬特发性血小板减少症引起的自发性出血有关，而在血小板计数升高时会并发血小板或内皮细胞功能障碍导致出血。本文将不再详细讨论血小板减少症，感兴趣的读者可查阅其它文献。而血小板本身存在功能问题时，称之为定性血小板疾病，与单纯的血小板数量减少症相比更罕见。分为先天性或后天性，通常可归类为以下几方面缺陷：粘附和表达血小板聚集抑制激活剂激活或次级信号缺陷血小板激活剂缺乏，通常储存在血小板颗粒内（储存池不足）先天血小板减少症遗传性血小板障碍分为“外源性”（即血小板或血管缺乏功能性蛋白质）或“内源性”（血小板自身疾病）疾病，表2总结了一些最典型的原发性凝血遗传缺陷。获得性血小板功能障碍获得性原发性凝血障碍的病理生理学特征较复杂，无典型症状，表3总结了常见疾病。药物调控血小板功能也可导致血小板功能障碍，从而降低血栓形成的风险。药物治疗可分为：ADP受体拮抗剂、血栓烷抑制剂和新型αIIbβ3整合蛋白受体拮抗剂。表4总结了其作用机制和作用持续时间。多项研究表明，阿司匹林和氯吡格雷对健康犬猫（包括患有亚临床心肌病的猫）的血小板功能具有抑制作用。但与人类医学研究结果相似的是，一些犬猫对抗血小板药物反应较差，称为“抗药性”（也称为“血小板高反应性”）。据报道，阿司匹林对犬的“抗药性”在19%-56%之间，并未报道猫的“抗药性”。氯吡格雷的血浆浓度存在很大的个体差异，主要是由代谢差异引起。FATCAT试验结果表明，氯吡格雷在降低复发性主动脉栓塞风险方面优于阿司匹林。可通过血小板功能试验或血小板活化标志物来评估个体对血小板抑制剂的反应，但应考虑以上两种方法的局限性，可能无法检测到血小板活性降低或与血栓形成的风险不相关。非甾体抗炎药（NSAIDs）对体外血小板聚集的影响不确定。一项体内研究表明，在子宫卵巢切除术前接受术前接受酮洛芬治疗的犬血小板聚集减少，但颊粘膜出血时间（BMBT）并未增加。在猫中的一项研究表明，使用美洛昔康14天后，血小板聚集未见减少。由于缺少其他非甾体抗炎药的数据，在围手术期使用非甾体抗炎药，尤其是并发原发性凝血障碍的动物，应慎重使用。前面提到的共识声明中详细讨论了围手术期使用抗血小板药物的具体指南，但还取决于血栓形成的风险和手术类型。众所周知输液疗法也可引起血小板功能障碍。一些对犬的研究表明，只有高渗盐水，不是羟乙基淀粉（HES）（/0.4）会导致血小板功能发生显著变化，这种变化不仅是血液稀释。一项在健康犬中进行的体外研究也报道了血小板功能障碍与血液稀释继发贫血相关的相关证据，但其临床重要性受到质疑。最近一项犬出血性休克模型研究表明，20ml/kg4%琥珀酰明胶与20ml/kg新鲜全血、6%HES(、0.4)和80ml/kg晶体液相比血小板功能降低。HES组还发现了其他明显的全身凝血异常，单纯休克与血小板功能轻度增强相关，提示高凝状态。一项猫的研究中，输注HES比单独的晶体液显著降低了凝血功能，但未评估血小板功能。甘露醇也被证实可损伤血小板聚集。总而言之，虽没有足够的数据来推断各种液体疗法是否会引起临床中血小板功能显著异常，但仅晶体疗法即可实现复苏，我们认为这是一种更安全的选择。血管性血友病（vWD）虽然不是严格意义上的血小板功能紊乱，但vWF的定性或定量缺陷是犬最常见的先天性出血性疾病。vWD的临床症状与血小板功能紊乱相似，创伤或手术后粘膜出血或大量出血更为常见。由于vWF作为因子VIII的载体，与活化部分凝血活酶时间（APTT）可能同时发生。血管性血友病是一种遗传性、常染色体隐性遗传突变。三种形式的vWD（1型到3型）在犬中很好识别，并根据血浆vWF的浓度和多聚体大小以及出血严重程度来评估。根据异常基因的不同表达，患有1型vWD的犬有不同的出血倾向。此外，虽然3型vDW的犬可能会出现严重出血，但也有报道表明犬仅出现轻微的粘膜出血。表5总结了不同类型的vWD。在猫中，仅报告了3例vWD，均为3型vWD。虽极为少见，但仍应在患有原发性凝血功能障碍临床症状的猫中考虑vWD。在机体vWF正常的状态下，由于各种获得性因素而发生获得性血管性血友病（AVWS），其并发疾病可导致vWF血浆清除率增快或减慢。据报道，在犬中，AVWS与甲状腺功能减退有关。在静脉注射胶体液后，继发于尿*症并伴有急性肾损伤，也可能与血管平滑肌细胞感染相关。通过测定低（I型）或极低（III型）vWF抗原浓度来诊断I型和III型vWD(vWF:Ag)。II型vWD的犬vWD:Ag水平可能正常，但由于缺乏大型vWF多聚体，从而导致胶原蛋白结合减少和原发性凝血功能障碍的临床症状。II型vWD通过测量vWF胶原蛋白结合活性（vWF:CBA）或vWF多聚体模式进行诊断，但这两种诊断方法均无商业化产品。表6总结了可用于vWD的诊断试验。多种因素可能会干扰诊断（如，全身性疾病和手术会影响vWF:Ag），因此，对于先天性vWD的诊断，理想情况下对于某些品种的犬应通过DNA基因检测来进行（见表6）。
4
血小板功能异常导致病理性血栓形成
病理性的血栓形成是指高凝状态或血栓。Virchow’s三特征描述了病理性血栓形成的三大类，包括内皮功能障碍、高凝状态和淤血，均可影响血小板功能。内皮功能障碍继发于炎症的内皮功能障碍可导致内皮细胞活化和血小板直接粘附。还可以干扰血小板抑制剂，如前列环素和NO的产生。内皮细胞的激活还可导致大型vWF多聚体的分泌增加，同时ADAMTS-13减少或缺乏。高凝状态炎性细胞因子可触发凝血级联反应，导致凝血酶的产生和血小板的活化但不发生粘附。这些血小板在正常刺激下也可大量聚集。活化的血小板也提供一个促凝膜，并释放激活剂以进一步维持聚集。瘀血瘀血区是缺氧的结果，缺氧可上调P-选择素，聚集炎性白细胞，作为凝血酶生成和进一步血小板活化的来源。
5
血栓栓塞的临床症状
临床症状与消耗性凝血病伴微血管血栓形成或血栓栓塞（TE）疾病有关。消耗性凝血疾病通常与血小板型出血的症状有关，而TE疾病的部位决定临床症状（见表7），可借助高阶影像进行诊断。兽医学中未发现遗传性血栓形成的报道，因此如存在TE疾病的临床症状，需要对潜在疾病过程进行诊断。同样重要的是要考虑对已知易患TE疾病的疾病过程患者进行预防性治疗。表8总结了导致显性疾病或微血管血栓形成的疾病过程。虽然有证据表明，在兽医学中，高凝状态下，目前血小板功能增强的证据不足。
6
血小板功能障碍的诊断方法：出血
一旦怀疑有原发性凝血功能障碍的临床证据（瘀斑、瘀点、粘膜出血、静脉穿刺后出血），应进行诊断性检查，以区分原发性凝血功能障碍的不同原因。图4总结并概述了诊断方法，如下：图4血小板型出血性疾病动物的诊断步骤CBC和血小板评估进行血小板功能测试前，需进行CBC排除贫血和血小板减少症（见图5）。真实的血小板数量和大小也应用高质量的血涂片进行评估，因为自动血细胞计数器可能会报告假性血小板减少症。猫的假性血小板减少症通常是由于血小板聚集导致（图6）。红细胞和血小板的体积也相似，导致阻抗分析仪的错误分类。图5.使用血涂片排除血小板减少症导致的血小板型出血图6.犬血小板团（改良瑞姬染色x50倍放大）PT/APTT检测通过凝血酶原时间和APTT评估继发性凝血级联模型的体外内源和外源途径。当体格检查提示原发性或继发性凝血缺陷（如粘膜出血）时，该检查尤其有用（图7）。图7.猫血小板团（改良瑞姬染色×倍放大）BMBT检测BMBT适用于有出血迹象但血小板计数和PT/APTT正常的动物（图8）。必须使用特定的BMBT刺血针。参考范围是设备特定的，通常犬小于4min，猫小于2min。麻醉和镇静可轻度延长BMBT。在排除贫血和血小板减少症且PT/APTT正常的动物中，BMBT延长可能反映血小板减少症、vWD或更少见的血管壁疾病。同时要了解BMBT的局限性，该检查具有很大的主观性，并且容易出现观察者之间和观察者内部的显著差异。因此，应始终谨慎地解释结果，并通过更具体的测试进行验证。BMBT切口浅表，例如只刺激血小板栓塞的形成，因此不建议作为手术出血的预测指标。图8.颊粘膜出血时间vWF抗原如果BMBT延长，则表明vWF:Ag测定可区分I型和III型vWD与血小板减少症。如前所述，vWF:Ag无法诊断II型vWD，因为血浆vWF抗原浓度可在正常范围内。由于BMBT的局限性，任何出现血小板出血症状且血小板计数和BMBT正常的动物也应考虑进行vWF:Ag测定。传染病附加筛查如果根据上述诊断程序怀疑血小板功能障碍，还应对生活在影响血小板功能的寄生虫流行的地区或有旅行史的动物进行传染病筛查。血管圆线虫是一种可引起凝血障碍，包括血小板功能障碍的常见传染病。快速内源性抗原检测具有较高的敏感性和特异性（94%和95%）。然而，最近的一项研究表明，支气管肺泡灌洗的定量PCR可能具有更高的敏感性。钩端螺旋体病也可引起血小板功能不全，应根据临床实际情况进行诊断检查。基因检测如果在易患先天性血小板功能紊乱（表2）或vWD（表5）的品种中怀疑血小板功能障碍或vWD，可以考虑进行基因检测。可以对EDTA样本或口腔拭子进行先天性缺陷的DNA检测。血小板功能检测对于血小板计数和vWF:Ag正常的血小板型出血动物，可进行血小板功能测试（但大多数需专业机构进行检测）。血小板功能障碍的诊断方法：血栓形成对于表现为可能由TE疾病引起的临床症状的动物，应提供完整的数据，包括CBC、血涂片检查、生化和尿液分析（包括尿蛋白:肌酐比值）。D-二聚体（一种纤维蛋白降解产物）可通过一些内部分析仪和外部实验室进行测量。低D-二聚体浓度对高凝状态有很好的敏感性，但对潜在原因的识别能力有限。凝血酶原时间和低于参考区间的PTT值也可能提示高凝状态。影像学诊断可用于发现血栓的存在（表7），也可排查可能导致血栓形成的潜在疾病（表8）。如果怀疑有潜在的心脏病，也可进行超声心动图检查。如果怀疑或发现血栓，血小板功能测试有助于确定血小板活性的增加是否有助于血栓的形成。
7
血小板功能障碍的诊断方法：血栓形成
对于表现为可能由TE疾病引起的临床症状的动物，应提供完整的数据，包括CBC、血涂片检查、生化和尿液分析（包括尿蛋白:肌酐比值）。D-二聚体（一种纤维蛋白降解产物）可通过一些内部分析仪和外部实验室进行测量。低D-二聚体浓度对高凝状态有很好的敏感性，但对潜在原因的识别能力有限。凝血酶原时间和低于参考区间的PTT值也可能提示高凝状态。影像学诊断可用于发现血栓的存在（表7），也可排查可能导致血栓形成的潜在疾病（表8）。如果怀疑有潜在的心脏病，也可进行超声心动图检查。如果怀疑或发现血栓，血小板功能测试有助于确定血小板活性的增加是否有助于血栓的形成。血液取样当采集血样以评估血小板数量或功能时，需进行无创伤性静脉穿刺以最大程度减少血小板的活化和聚集。对于血小板功能测试，采集血样时，应使用蝶形采血针并连接在真空抗凝管上。根据要进行的诊断测试选择合适的抗凝剂。由于初次静脉穿刺时会激活血小板，因此必须丢弃第一个样本。轻轻倒置抗凝管并旋转以混合血液和抗凝剂。样品须在采集后2小时内进行处理，如果在任何阶段出现意外，应重新收集样品进行分析。血小板功能特异性试验血小板功能检测可用于诊断血小板功能增高和降低。虽然血小板功能涉及多种体内机制，但这些体外试验仍能提供重要的临床信息。大多数血小板功能测试的主要局限性之一是需要立即进行样本处理以获得准确的结果。下面讨论的医院的床边护理设备进行，兽医临床中，目医院可做到。包括：剪切力下血小板粘附的评估（血小板功能分析仪(PFA)）；血小板凝集（透光率比浊仪（LTA））；整体评估（血栓弹性成像（TEG）±血小板定位和旋转血栓弹性测定（ROTEM））等，详细方法见原文。评估血小板成分和血小板活化标志物的试验流式细胞术特异性血小板特征，如受体和颗粒含量，用荧光单克隆抗体标记。当通过激光束时，结合的抗体会发射特定波长的光。这可以在刺激前或后用各种激动剂进行，包括ADP、胶原蛋白、凝血酶和肾上腺素。因此，虽然流式细胞术不能直接评估血小板功能，但它可以用来检测是否存在正常成分或活化标志物。血浆平均血小板成分（MPC）浓度当活化的血小板脱颗粒时，密度降低。这可以用由血小板折射率导出的血浆平均血小板成分（MPC）浓度来评估。这个值可以从一些自动血液分析仪获得。脓*症和非脓*症炎症犬的血小板P-选择素表达增加，血浆MPC浓度降低，据报道，与健康狗和其他疾病犬相比，患有IMHA的狗血浆MPC浓度显著降低，并且与存活率显著相关。
8
总结
总之，我们诊断血小板功能障碍的能力正在增强。尽管许多先进的血小板功能测试在初级保健实践中不可用，但对这些动物进行合理的初始检查仍然是可行的。目前广泛应用这些测试的后勤限制主要集中在设备成本和分析新鲜血液样本的要求上。随着进一步的研究，这些局限性可能会被克服，或者应用其他评估血小板功能障碍的策略，例如远程分析活化标志物。这可能导致初级保健和转诊级别的临床医生能够执行更深入的诊断工作，并针对TE患病动物进行特异性的抗血小板治疗。
9
参考文献
校对聂静编辑ShirleySU译者：徐彩霞内科、检验科专科医生维特（深圳）医院预览时标签不可点收录于话题#个上一篇下一篇
