近日（8月31日），上海邦耀生物科技有限公司与华东师范大学、浙江大医院合作的非病*定点整合CAR-T技术（QuikinCART）研究成果，正式在Nature杂志上发表。这是国内首次发表于国际顶级期刊Nature的CAR-T研究成果，也代表了中国的下一代CAR-T技术取得了巨大的突破。
QuikinCART可在不使用病*载体的情况下，通过一步制备获得基因组定点整合的CAR-T细胞产品。该平台克服了传统病*载体CAR-T疗法成本高、随机插入引起致瘤风险等难题，简化了复杂的生产工艺，缩短了CAR-T的制备时间。
基于该平台开发的靶向CD19的非病*PD-1定点整合CAR-T产品（BRL-）已在复发/难治性非霍奇金淋巴瘤患者的治疗中显示出高安全性和有效性。首例接受治疗的患者至今已疾病完全缓解(CR)超过2年。
QuikinCART突出的表现意味着传统细胞疗法的许多挑战正在通过使用新兴的生物工程方法加以解决。近期，NatureReviewsDrugDiscovery发表了题为“Engineeringthenextgenerationofcell-basedtherapeutics”的论文。
这篇综述具体分析了基因编辑、合成生物学和生物材料这三大改造利器在补充和增强细胞疗法上的应用，并探讨了这些策略未来可能创造的新模式，以突破当下疗法的局限性。
PREFACE前言人类细胞疗法在年代以骨髓移植形式首次出现，用于治疗血液瘤患者。往后几十年，以造血干细胞（HSC）、造血祖细胞（HPC）作为主要来源的细胞疗法在临床上得到广泛应用。过去20年里，免疫细胞疗法经历了飞跃式的发展。在此期间，用于血液瘤的CAR-T产品已经进入市场，总体技术发展趋于成熟；肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）疗法攻克了实体瘤难题，且接近上市；颇具前景的自然杀伤(NK)细胞疗法也有了临床进展，主要发展方向是开发通用型产品。不过，无论哪一类方法都有着各自的“短板”，要开发一款新的疗法开发，必须克服一系列重大挑战，包括如何确定适当的细胞来源，如何生产出足够可行、有效和安全的产品等。
图1：细胞治疗开发过程中各环节可能遇到的挑战。细胞来源选择作为起点，对于下游细胞治疗的产品的稳定性、安全性有着很大影响。规模化生产难也是目前行业的一个巨大瓶颈。最后，临床应用中的检测、运输、储存比一些早期的生产过程更具挑战性。
为应对细胞治疗当前面临的阻碍，科学家们正在探索细胞工程的创新，包括基因组和表观基因组编辑、合成生物学以及生物材料的使用。其中一些方法已实现临床转化，一些方法尚处于临床前阶段。
01基因组和表观基因组编辑CRISPR基因编辑系统作为一种工具，能够高特异性地编辑细胞的基因组，这让研发人员有机会对多个用药物无法靶向的基因进行改造，从不同角度为细胞疗法带来突破。技术路线一：基因组编辑用于纠正单基因疾病。CRISPR–Cas系统首先在特定位点触发双链DNA断裂（DSB），再通过非同源末端连接（NHEJ）或同源定向修复（HDR）对双链DNA断裂进行修复后基因组编辑就会发生（下图2）。
图2：基因编辑的发生
Cas9介导NHEJ的技术路径已被用于沉默致病基因座、去除有害插入或赋予对病*的抗性等。例如，具有里程碑意义的研究表明，Cas9介导BCL11A红系增强子的切割，可用于治疗镰状细胞病或β-地中海贫血。BCL11A是这两种罕见遗传病中导致胎儿血红蛋白表达（HbF）下调的转录因子。
基于该策略开发的BCL11A基因修饰造血干细胞疗法，包括CRISPRTherapeutics和VertexPharmaceuticals的CTX、邦耀的BRL-、博雅辑因的ET-01等，现已在临床上显示出强大的治疗潜力和可控的安全性。
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技术路线二：基于CRISPR–Cas的基因组编辑技术非常适合多路复用，可用于改进基于细胞的疗法，包括CAR-T疗法。
首先，这一成果为通用CAR-T细胞打开了大门。利用CRISPR/Cas9系统同时破坏多个基因位点产生TCR和HLA-I缺陷的CAR-T细胞，可以减少移植物抗宿主病（GVHD）和免疫排斥反应的发生。该策略在开发通用型CAR-T细胞中已被广泛应用。除了产生通用的CAR-T细胞，CRISPR-Cas9技术也可以通过敲除编码信号分子的基因如PD1和CTLA4或编码T细胞抑制性受体的基因来提高CAR-T细胞的功能。
例如，宾大团队曾在慢病*递送CD19CAR的基础上，使用CRISPR–Cas9同时靶向T细胞上的内源性TCR、β2-微球蛋白(β2m)和PD1基因（下图3），生成了低免疫原性的同种异体CAR-T细胞（参考资料2）。
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图3：CAR-T的多重基因编辑
技术路线三：核酸酶失活的CRISPR-Cas系统不会产生DSB，但仍可以精确靶向基因组DNA。
基于dCas的表观基因组编辑平台可实现稳健的转录激活或抑制（分别为CRISPRa或CRISPRi），用于塑造基因调节和细胞功能（下图4）。
图4：基因组和表观基因组编辑
dCas是指通过点突变失去核酸酶活性的Cas蛋白，它保留了Cas结合DNA的能力，但却不切割DNA双链。将dCas与转录激活蛋白结合，就能实现对特定基因的激活，即CRISPRa；而将dCas与转录抑制蛋白结合，就能实现对特定基因的抑制，即CRISPRi。
CRISPRa和CRISPRi已经为功能性基因的筛选带来革命性的变化，它能够在多种细胞中进行迅速、特异性、高通量的基因编辑。目前已有许多基础研究利用CRISPRa或CRISPRi大规模筛选出了肿瘤免疫治疗的潜在靶标，并了解到基因在细胞中的更多功能，为各大疾病领域带来更多新的见解，大大加速下一代细胞治疗方法的开发。
技术路线四：用于设计细胞治疗的有利特性。
基因组和表观基因组编辑还为细胞疗法提供了更多创造和改变特性的机会。例如，在细胞分化之前进行基因组编辑，可以产生同质的细胞群，这可能降低细胞疗法的生产成本并实现大规模生产。
破坏iPSC中的HLA基因也已被证明是增强免疫相容性的有用方法。一些研究通过对iPSC进行HLA的等位基因特异性编辑，可以逃避T细胞和NK识别。类似的策略——敲除B2M并同时过表达CD47，也能够生成免疫原性显著降低的iPSC（下图5）。
基于这些方法的“现货型”iPSC疗法正在迅速取得进展，针对实体瘤和晚期血液系统恶性肿瘤的多项临床试验正在进行中，包括Fate公司的FT（NCT）和FT（NCT）。
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除了基因敲除外，CRISPR–Cas9还可以通过HDR修复实现非病*的CAR敲入（例如Fate公司的FT）。相比于不可预测的NHEJ途径，HDR介导的编辑可以在存在供体DNA模板的情况下，确保将基因精确插入特定基因座。该方法能够帮助提高CAR-T细胞疗法的稳健性，实现更均匀的CAR表达和增强的效力（下图5）。
图5：设计细胞治疗的有利特性
02合成生物学
合成生物学旨在通过应用定量设计规则，使基因工程结果更加精确、可预测和可重复。该领域在过去20年来快速发展，近些年已越来越多地应用到了细胞疗法的开发当中。合成生物学可以通过精确控制治疗性转基因的表达或分泌治疗因子的传递，增强细胞治疗的功能；也可以对细胞进行编程来感知与特定组织或疾病状态相关的生物分子，从而对细胞行为的改变作出反应，以增强细胞治疗的靶向特异性（下图6a）。
合成生物学当前主要的努力目标是提高细胞治疗效力、PK/PD和安全性，但合成生物学未来还将有潜力为细胞疗法解决更多挑战，包括扩大可用于治疗的细胞类型谱，以及使制造过程更加高效和稳健等（下图6b）。
图6：合成生物学的应用与挑战
具体来看，小分子“On/off开关”是这一领域成功的应用之一。利用小分子药作为“开关”设计的CAR-T细胞主要有两种场景：当CAR-T细胞在体内过度激活，产生细胞因子风暴等副作用时，小分子可启动让细胞失活的基因线路，将其沉默；反之，还可以先注射失活的CAR-T细胞，再通过小分子药进行浓度依赖性的激活（下图7）。
合成生物学CAR-T的另一个重要焦点是开发增强肿瘤靶向特异性的策略，着眼于实体瘤治疗。SynNotch系统就是一个众所周知的例子。SynNotch是一种合成的Notch受体，通过基因工程在T细胞表面永久性地表达。其膜外结构也是抗体片段，可识别并结合抗原A，引起SynNotch的膜内肽链被裂解，释放出连接的转录因子。转录因子进入细胞核后，会特异性地启动第二个CAR的转录表达，插入细胞膜。如果遇到第二个抗原B，会进一步激活下游信号，进入杀伤模式。SynNotch技术相当于给T细胞装了一个“与门”，只有在接触到的细胞表达两种抗原A和B的情况下，才会被激活（下图7）。
图7.合成生物学CAR-T
此外，使用合成生物学设计具有“sense-process-respond”能力的基因回路，还能够将多个靶标信息与生物学逻辑整合在一起，以此监测生理或疾病状态特征，并作出治疗性的反应（下图8）。
图8.合成生物学基因回路
03生物材料
半渗透性生物材料、水凝胶生物材料的使用可辅助治疗用细胞的递送，改善细胞在组织环境中的生物活性，并促进控释以提高安全性。当前该领域的重点研究方向在于开发长期有效的封装技术，保护治疗用异体细胞免受人体免疫系统的排异。
免疫排异反应的产生需依赖细胞间的接触，因此用半渗透性材料对细胞进行封装、或用水凝胶进行包裹，都提供了一种物理屏障，以阻碍免疫系统的激活（见图9）。
图9.克服免疫排斥的策略
生物材料细胞封装技术已在肿瘤、内分泌、神经内分泌、眼科疾病等领域开展临床评估。例如，ViaCyte公司的PEC-01将用于治疗1型糖尿病的诱导胰岛素分泌β细胞封装在半渗透封装袋中，以防止免疫排斥，延长细胞的活力和维持血糖水平。此外，基于特制的水凝胶包裹CAR-T细胞和细胞因子，已应用到了实体瘤治疗的临床前研究中，实现了肿瘤部位CAR-T细胞的持续释放，同时支持其体内扩增（参考资料3）。
不过值得注意的是，封装技术需考虑异体细胞与外界的双向物质交换，例如从外界流入葡萄糖、氧气等养分以维持细胞生命，从内部流出工程细胞产生的治疗性蛋白分子。而其中的挑战在于，免疫细胞对生物材料的排异反应（FBR）会使材料内部逐渐产生纤维化和缺氧问题，难以实现长期有效的治疗效果。
面对该挑战，科学家还正在尝试使用免疫调节小分子修饰的水凝胶、两性离子PCBMA水凝胶等新型材料，并已在动物实验中观察到了积极的结果（参考资料4）。
SUMMARY小结
细胞治疗作为一种与传统药物截然不同的“活”药物，在开发进程中存在着诸多来自真实世界的挑战。为解决以往难以治疗的疾病让更多患者受益，当前的细胞治疗技术亟需进一步改进和创新升级。
在基因编辑、合成生物学和生物材料的助力下，更强靶向性、更优安全性、以及通用型的细胞治疗产品已经在路上，同时业界也期待更多新技术、新材料和创新治疗策略，以解决更多未满足的临床痛点。
