引言：克隆造血(CH)广义地描述了具有一个或多个体细胞突变的克隆血细胞群的扩展。CH患者发生血液系统恶性肿瘤、心血管疾病的风险更高，非血液系统癌症的死亡率也更高。理解CH的起因以及这些突变细胞如何与其他组织的细胞相互作用将为白血病前发育、干细胞生物学、宿主免疫相互作用和癌症进化提供关键的见解。在这里我们讨论CH的临床表现，促进其发展的机制，CH在白血病克隆进化中的作用，以及CH在非血液学疾病状态中的贡献。
01
Introduction
造血系统每天产生数万亿细胞，其中有多种类型的细胞，包括红细胞、巨核细胞、血小板、淋巴细胞、单核细胞和粒细胞。为了实现这一输出，造血系统采用了广泛的细胞层次结构，将自我更新隔离到少数造血干细胞(HSCs)，并提供增殖能力来扩增祖细胞。因此，由单个干细胞产生的祖细胞和成熟细胞代表了一个克隆谱系。当一个星状细胞分裂时，它可以对称地产生两个子星状细胞，也可以不对称地产生一个星状细胞和一个子细胞，为分化和随后的成熟细胞的产生做准备。随着时间的推移，即使是缓慢分裂的造血干细胞也可能获得突变，并传递给下一代细胞，影响造血干细胞的室间细胞和子细胞。虽然许多体细胞事件会产生中性效应，但与其他克隆相比，促进干细胞状态自我更新、增殖和/或减少细胞死亡的突变有能力以不成比例的速度扩大星状细胞克隆。这种相对于其他克隆谱系的适应性优势是CH的定义特征。
造血细胞游走到身体的不同组织，影响许多不同器官系统的体内平衡。因此，骨髓的克隆性扩增不仅具有恶性肿瘤的风险，而且与许多器官系统存在交叉点，因此造血干细胞内的生物学改变可能导致来自该突变造血干细胞的终末分化细胞(如巨噬细胞)的通路异常激活。在篇文章重点回顾了CH的临床鉴定，与CH相关的选择性压力，CH的突变如何影响我们对干细胞生物学的理解，以及这些突变如何影响白血病的发展。
02
Maincontents
CH的鉴定及与其他无性系血液病的鉴别
针对已知与血液学恶性肿瘤相关的基因(包括TET2和DNMT3A)进行测序分析，已用于识别健康成人血液中的体细胞变异。特定基因的突变谱具有不同的分布。例如，DNMT3A-RH热点突变在AML中富集，在CH的健康个体中则不那么丰富。而其他AML相关基因突变如FLT3、NPM1、IDH1和IDH2在TCGA患者血液中很少发现。WGS、WES和靶向测序之间的技术差异在热点突变的相对富集方面产生了有时相互矛盾的数据;然而，作为一个整体，这些研究的互补性质揭示了许多关于CH的突变谱。
研究发现，当血液中发现体细胞突变时，血液系统恶性肿瘤的发展速度会加快。这表明这些细胞处于白血病前状态，但也模糊了临床良性克隆扩张和更有意义的异常之间的界限。有一系列术语来描述这些状态，包括意义不明确CH（CHIP），与年龄相关的CH（ARCH），意义未定的特发性血细胞减少症（ICUS）和意义未定的克隆性血细胞减少症（CCUS），它们共享许多重复且相似的临床描述。通常，ARCH和CHIP是技术发现，而不是疾病，被描述为存在无血细胞减少症的体细胞变异，而ICUS被认为存在低水平的血细胞减少症而无可检测的体细胞变异。从正常的骨髓检查中，CCUS已被提供给患有血细胞减少症和体细胞变异的患者的普通话（图1）。在此，WHO指南指出血友病的阈值是血红蛋白10g/dl，绝对中性粒细胞计数1.8×/l或血小板计数×/l。除了这些参数之外，区分这些状态还需要使用VAF阈值来区分一个人是否具有与血液系统恶性肿瘤相关的真正的体细胞突变。有人建议将2％的VAF用作临界值，该值可能会随着测序技术的发展和更多数据的获得而被修改。
CH中也存在许多与MDS发育相关的基因以及更惰性的血细胞减少症（CCUS），包括ASXL1和TET2的突变。这些数据表明，尽管不是一定的，但CCUS和MDS都可能是来自先前CH克隆的自然进展。因此，由MDS或MPN诊断产生的继发性AML有可能是CH克隆发展为CCUS，MDS以及最终AML所产生的紧急恶性事件（图1）。
图1：克隆造血与选择性压力和继发性血液病的关系
橙色突出显示的是可能产生CH体细胞变异的诱变应激的潜在来源，包括老化相关的诱变、化疗诱导的体细胞变异和暴露于外源性遗传*性应激(包括吸烟)。化疗和衰老也可以作为选择性压力(用双头箭头表示)，如果体细胞变异有更好的适应性，则可以选择它们。这些选择压力可导致克隆生长(如图2所示)，CH体细胞变异的发展也可直接导致AML或MDS的新生形成。CH之后可能出现CCUS中明显的细胞减少，再加上发育不良导致MDS。作为chc的结果，AMLdevelopment可能来自MDS中间产物，但也可能绕过这一进程。CH,克隆造血作用;CCUS，意义不明的克隆性细胞减少;MDSmyelodysplatic综合症;急性髓系白血病。
与CH相关的选择性压力
文章中还回顾了导致CH的选择性压力和健康状况的特征。这包括与衰老相关的CH和治疗诱导的选择性压力，后者推动了特定数量克隆的出现(图2)。此外，自身免疫和微环境改变也有可能推动克隆选择。
图2：选择压力下的克隆扩张：A)在负选择下的无性系进化(带有有害事件、无体细胞变异、中性选择和带有有利事件的正选择)的示意图。(B-D)对选择性压力的描述:(B)衰老;(C)、化疗;(D)免疫介导压力。克隆生长以x轴表示时间，以y轴表示星状细胞克隆的相对丰度。虚线表示选择压力存在的时间。圆点的颜色表示所显示的体细胞变异。(E)随机漂变显示了单个造血干细胞无性系的生长，产生了不同蓝色深浅的中性子细胞。右边的条形图表示每个无性系经三代星状细胞分裂后随机漂移的星状细胞丰度。
与年龄相关的突变获取和选择压力
与CH发生最明确的临床关联是衰老，几乎所有研究都对这一发现进行了概括。衰老还与CH恶化为更恶性的血液学状态的倾向相关联，同时也与许多血液学并发症有关，包括贫血，先天性和适应性免疫缺陷以及MDS，MPN和AML的患病率增加。要了解衰老促成CH的机制，必考虑时间对克隆分布的累积影响以及衰老的HSC的分子和细胞特性。
在单个细胞的基础上，尽管免疫表型定义的造血干细胞的数量总体增加，但衰老的造血干细胞的移植能力下降。这种功能上的改变很可能创造了一个健康的环境，这样，最能保持自我更新和分化能力的造血干细胞最有可能扩张。这种功能下降背后的分子机制可能涉及年龄相关的DNA损伤增加和氧化应激相关的DNA损伤。通常，C:TDNA碱基对转换是复制突变最常见的结果，这种转换是老化相关突变的标志。
这些分子事件可能会形成一种有利于造血干细胞保持自我更新、阻止分化和解决DNA损伤而不启动细胞凋亡的适应性状态。表观遗传修饰剂DNMT3A、TET2或ASXL1的突变将非常适合通过最大化自我更新和实施分化阻断来提供相对于非突变克隆的选择性优势;与此同时，DNA损伤调控因子(如TP53和PPM1D)的突变可能在面对遗传*性压力时提供了类似的适应优势。
治疗诱导的CH和选择性压力
除了与衰老相关的突变过程和内源性遗传*性应激外，外源性应激（例如由放射或化学疗法引起的应激性应激）也可能导致改变了健康状况，从而促进了CH。特别是针对非血液学疾病或自体干细胞移植治疗条件疗法一部分接受过化学疗法治疗的患者，两项研究特别丰富。除了反复发现的表观遗传修饰子（DNMT3A，TET2和ASXL1），有研究还观察到TP53，PPM1D，ATM和CHEK2的反复突变，它们都在对DNA损伤的反应中起一定作用。这些突变表明，在遗传*性压力下，例如化学疗法或放射线照射后，可能会发生抗DNA损伤的克隆的扩增。也有研究发现，t-AML患者中TP53突变的发生频率高于新生AML患者，且TP53突变可在遗传*性侵害导致克隆扩增后提供选择性优势，克隆扩增是t-AML的极端发展。
在对大批患者进行的基因组研究后发现，与原发MDS相比，TP53和PPM1D突变在治疗诱导的MDS中均富集，表明了带有这些突变的克隆在治疗诱导的选择压力下会扩增。研究表明DNA损伤信号通路中的突变并不是化学疗法或先前治疗的结果。而是，由治疗引起的遗传*性应激施加了增加的选择性压力，使得相对于具有完整DNA损伤反应的细胞，这些先前中性的突变现在提供了积极的选择性优势。
这与TET2等基因的突变形成鲜明对比，TET2基因的突变通过增加的自我更新为干细胞提供了直接的选择优势，即使在没有治疗诱导的遗传*性损伤的情况下也是如此。此外，最近的研究表明，DNMT3A-RH中的点突变增加了干细胞的频率，类似于TET2。但是，与TET2突变不同，DNMT3A-RH突变而不是DNMT3A功能丧失导致蒽环类药物耐药。因此，取决于是否在RH热点发生突变，DNMT3A突变在不进行治疗的情况下可能具有积极的选择优势，而在蒽环类药物治疗的情况下可能具有其他的选择优势。
与CH相关的表观遗传突变及其在干细胞生物学中的作用
了解这些克隆中突变的基因的生物学特性可帮助我们正确了解这些选择性压力如何导致HSC的克隆扩增。CH中最常见的体细胞突变存在于与表观遗传修饰相关的基因中，包括TET2，DNMT3A和ASXL1，以及与剪接因子相关的基因，包括SF3B1，SRSF2和U2AF1。
图3：克隆性造血的表观遗传调控因子DNMT3A通过招募PRC2复杂成员EZH2来催化CpG甲基化（黑色圆圈），TET2生成5hmC（蓝色圆圈）和ASXL1生成H3K27三甲基化（红色圆圈）的示意图。右侧列出了功能丧失和血液系统疾病的关联。鼠标和人类数据支持的发现分别以“m”和“h”表示
TET2和DNMT3A协调干细胞中的DNA甲基化
DNA甲基化在基因调控和塑造细胞身份中起着至关重要的作用，尤其是在启动子上的甲基化通常被认为是抑制性标记。该调节过程的核心是负责建立甲基化标记的酶，DNA甲基转移酶（DNMT）和十一个十一易位（TET）家族，它们能够去除这些标记（图3）。通常认为DNMT1在维持已建立的甲基化标记中起作用，而DNMT3A/B被认为负责建立从头甲基化标记。TET家族的三个成员TET1/2/3是甲基胞嘧啶双加氧酶，主要负责催化5-甲基胞嘧啶（5mC）转化为5-羟甲基胞嘧啶（5hmC）和随后的羟化事件。因此，TET2的丧失与DNA甲基化过度有关，而DNA甲基转移酶3A（DNMT3A）的功能丧失突变与甲基化不足有关，这种关联一直持续到恶性肿瘤（图3）。尽管其他TET和DNMT家族成员能够催化这些反应，但TET2和DNMT3A仍然是血液恶性肿瘤中突变的主要家族成员和CH中最常见的突变基因。有数据表明，在DNMT3A突变AML中发现的低甲基化模式先于白血病发展，并可能在CH进展中起作用。
与DNMT3A丢失相反，TET2功能缺失突变与甲基化高度相关。TET2是一种Fe（II），α-酮戊二酸，O2依赖的双氧合酶，其活性已显示出被维生素C诱导。最近在小鼠中进行的研究表明，维生素C在HSC中含量丰富，其戒断模拟了TET2丧失导致HSC扩展的功能。此外，HSCs已显示存在于低氧的血管周围生境中。综合考虑，这些因素可能有助于对HSC中TET2酶活性的微调控制。未来在CH的环境中用维生素C调节TET2活性的研究可能会提供有关克隆扩增潜在可逆性的见解。
值得注意的是，在与CH相关的基因中IDH1和IDH2突变相对缺乏，因为AML中频繁发生的早期打击在CH中极为罕见。IDH1和IDH2中的突变导致新代谢物2-羟基戊二酸（2-HG）的产生，后者是α-酮戊二酸依赖性双加氧酶（包括TET2）的有效抑制剂。在骨髓恶性肿瘤中，IDH1/2和TET2中的突变在很大程度上是互斥的，这支持了IDH1/2突变体部分通过下游对TET2的抑制而起作用的观点。理解为什么IDH1/2突变在CH中不像TET2突变那么丰富，可能有助于深入了解是否有不同的机制导致CH的发展和无CH的AML引发。一个答案可能是2-HG功能的多效性。除了抑制TET2外，2-HG还抑制了许多酶，导致导致H3K27，H3K9和H3K4甲基化增加的一系列组蛋白脱甲基酶。这种组蛋白甲基化导致染色质在DNA损伤调节剂Atm周围凝结，从而降低了表达水平，尤其是在老年小鼠中。随后发现IDH1/2突变细胞具有增加的53BP1病灶和对柔红霉素的敏感性。因此，IDH1/2突变体可能呈现与DNMT3A-RH突变体克隆相反的情况，其中IDH1/2突变在存在基因*性胁迫时导致负的选择性压力。IDH1/2突变体细胞在衰老后与TET2突变体进一步分化，其中IDH1突变体的长期HSC频率降低，而衰老则加剧了这些细胞在TET2突变体中的扩增。其他解释可能包括对周围骨髓生境对2-HG的潜在非细胞自主作用，从而为AML的发展提供了支持性环境。
克隆进化为血液学异常和白血病转化
再生障碍性贫血中的CH
CH和白血病发展之间的联系涉及进化进程，其中克隆可能获得额外的突变，从而赋予克隆更高的适应性。类似的原理适用于骨髓衰竭综合征，包括再生障碍性贫血，其中免疫过程施加了限制HSC池的选择性压力。近期对再生障碍性贫血患者血液的基因组研究确定了BCOR，BCORL1和PIGA突变反复发生，以及在与CH相关的其他研究中鉴定出的经常突变的DNMT3A和ASXL1。作者发现，尽管DNMT3A和ASXL1突变的发生率随年龄增长而增加，但PIGA和BCOR/BCORL1突变在所有年龄组中的代表均相同。此外，PIGA/BCOR/BCORL1突变与对免疫治疗干预的反应性增强相关，而与AML/MDS相关的突变患者的反应性较弱。这些数据提示再生障碍性贫血发展的至少两种不同模式：（1）免疫逃逸介导的克隆选择和（2）HSC自我更新介导的克隆选择。
DNMT3A中的突变与致癌突变协同作用，以促进恶性转化
DNMT3A是健康人群以及其他血液系统和非血液系统恶性肿瘤患者中CH中最常见的突变基因之一。此外，DNMT3A是成人AML和T细胞急性淋巴性白血病（ALL）中最常见的突变基因之一，根据不同人群，突变频率平均在22％至35％的患者之间。与之形成鲜明对比的是，DNMT3A突变在儿科疾病中极为罕见。这些发现使人们更深入地了解了CH作为成人疾病前体的作用，但表明其他机制可能在小儿白血病中起作用。大量成人AML队列已鉴定出受体酪氨酸激酶FLT3中的突变；RAS信号通路成员NRAS，KRAS和PTPN11；以及多功能核蛋白NPM1的突变。
TET2突变与JAK2和FLT3突变协同促进骨髓转化
像DNMT3A一样，已显示TET2突变与FLT3突变具有协同作用，从而导致了具有完全渗透性的AML的发展。TET2缺失会导致许多基因座被甲基化。而且这些位点随着组合的FLT3突变而发生了巨大变化，这表明了这两个突变之间的协同作用。尽管许多基因座的甲基化状态都发生了变化，但其中GATA2位点的甲基化和转录抑制似乎在疾病发展中起着致病作用。该基因座可作为监测TET2突变体CH及其向更具攻击性的疾病进展的潜在生物标志物。除FLT3外，TET2中的突变还显示出与肥大细胞中突变KIT的表达协同作用。但是在不同情况下，特定的疾病表型都不同，这表明由CH克隆获得的后续突变在指示疾病表型中起指导作用。
尽管与CH明显相关，但TET2突变并不总是作为白血病中的第一个或显性的克隆突变而存在。在TET2突变型AML中，一项通过变异等位基因频率推断克隆性和暂时性突变习性的研究表明，患者的疾病可能以TET2优先或JAK2优先出现。在这种情况下，JAK2为首发疾病的患者似乎患有更具侵略性的疾病，血栓形成和真性红细胞增多症的风险增加。
03
CH未来临床前景
在过去的几年中，CH已成为了深入研究的焦点。此文章研究表明，CH是一种常见的，年龄依赖性的状态，并且CH与随后发生的血液系统恶性肿瘤的风险增加，心血管疾病的风险增加以及晚期恶性肿瘤患者的不良结局有关。从临床环境来看，这导致了几个重要的考虑因素。这些中的第一个也是最重要的是与诊断有关。我们是否应该在人群基础上筛查CH，如果是，则筛查至何种深度以及针对哪些遗传改变？患者是否应将CH筛查作为心血管疾病风险评估的一部分？为了解决这个关键问题，未来将仔细评估基于人群的研究所收集的不断扩大的数据。
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